Die Dehnung von Muskelzellen induziert Transkriptions- und Spleißübergänge sowie Veränderungen in SR-Proteinen

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 987 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 10. Oktober 2022 veröffentlicht

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Alternatives Spleißen ist ein RNA-Verarbeitungsmechanismus, der an der Entwicklung und Pathologie der Skelettmuskulatur beteiligt ist. Muskelerkrankungen weisen Spleißveränderungen und Veränderungen in der Mechanobiologie auf, die uns dazu veranlassen, den Zusammenhang zwischen mechanischen Kräften und der RNA-Verarbeitung zu untersuchen. Nach der Dehnung der Muskelzellen führten wir eine tiefe RNA-Sequenzierung durch. Zunächst haben wir Transkriptionsveränderungen in Genen entdeckt, die für Proteine ​​kodieren, die an der Muskelfunktion und -transkription beteiligt sind. Zweitens beobachteten wir, dass zahlreiche mechanosensitive Gene Teil des MAPK-Signalwegs waren, der als Reaktion auf Dehnung aktiviert wurde. Drittens haben wir herausgefunden, dass die Dehnung von Skelettmuskelzellen den Anteil alternativ gespleißter Kassetten-Exons und deren Einschluss erhöht. Viertens haben wir gezeigt, dass die Serin- und Arginin-reichen Proteine ​​stärkere Transkriptionsänderungen aufwiesen als andere RNA-bindende Proteine ​​und dass die SRSF4-Phosphorylierung mechanosensitiv ist. Die Identifizierung von SRSF4 als mechanosensitives RNA-bindendes Protein, das zum Crosstalk zwischen Mechanotransduktion, Transkription und Spleißen beitragen könnte, könnte möglicherweise neue Erkenntnisse über Muskelerkrankungen liefern, insbesondere solche mit unbekannter Ätiologie.

Alternatives Spleißen ist ein RNA-Verarbeitungsmechanismus, der die Proteinvielfalt erweitert und in höheren Eukaryoten extrem verbreitet ist, wobei über 95 % der menschlichen Gene alternativem Spleißen unterliegen1. In der Skelettmuskulatur kommt es postnatal zu ausgedehnten alternativen Spleißübergängen2, die zur Reifung des kontraktilen Apparats beitragen3,4,5,6. Skelettmuskeln sind komplexe Gewebe, deren Entwicklung sowohl von molekularen Mechanismen als auch von mechanischen Eigenschaften abhängt. Der Muskelkontraktionsapparat besteht aus Sarkomeren, Quertubuli und Costameren, die zusammen Kraft sowohl über Muskelzellen als auch vom Zellkern zur Plasmamembran in einem Prozess übertragen, der als Mechanotransduktion7 bekannt ist. Interessanterweise kehren bei verschiedenen Muskelerkrankungen alternative Spleißmuster bei Erwachsenen in fetale Stadien zurück, was zu Muskelschwund, Atrophie und Funktionsversagen des Muskels führt3,4,8,9. Daher sind molekulare Übergänge im Skelettmuskel wichtig für die ordnungsgemäße Entwicklung des Gewebes.

Neben molekularen Übergängen während der Entwicklung muss die Skelettmuskulatur auf mechanische Kräfte reagieren und durch Kontraktion koordinierte Kraftstöße erzeugen. Muskelzellen reagieren besonders empfindlich auf Mechanotransduktion10; Die Steifheit ihrer Umgebung steuert die Zelldehnung und -differenzierung, die wiederum für eine effiziente Muskelkontraktion von entscheidender Bedeutung sind11. Im Vergleich zu gesunden Personen sind die Muskelzellen von Menschen, die an Muskeldystrophie leiden, steifer, und es wird angenommen, dass dies die ordnungsgemäße Kontraktilität verhindert, was letztendlich zu Muskelschwund führt11,12,13.

Es wurde umfassend nachgewiesen, dass globale Fehlspleißungen oder Fehlregulierungen einzelner alternativer Spleißereignisse zum Verlust der ordnungsgemäßen Muskelfunktion führen2,3,4,6,14,15. Mäuse mit Duchenne-Muskeldystrophie (die das Spleißen fehlreguliert) weisen Veränderungen in mechanosensitiven Signalwegen auf, was darauf hindeutet, dass physische Veränderungen im Muskel mit molekularen Reaktionen verbunden sind16. Diese Idee erweiternd zeigen alternde Mäuse mit Muskeldystrophie eine verringerte Müdigkeit als Reaktion auf einen Eingriff, der sowohl eine Splice-Switching-Therapie als auch körperliche Betätigung umfasst17. Diese Studien belegen einen Zusammenhang zwischen Muskelerkrankungen, Spleißfehlregulationen und mechanischen Veränderungen des Muskels. Es ist jedoch nicht bekannt, wie mechanische Kräfte und alternatives Spleißen zusammenwirken, um die Muskelhomöostase aufrechtzuerhalten, und in welchem ​​Ausmaß sie zur Entstehung von Muskelerkrankungen beitragen.

In dieser Studie untersuchen wir mithilfe von Deep RNA-Sequencing (RNA-seq), wie sich die Dehnung von Skelettmuskelzellen auf globale alternative Spleiß- und Genexpressionsprogramme auswirkt. Wir haben herausgefunden, dass mechanisches Dehnen umfangreiche Transkriptionsänderungen in Genen induziert, die für Proteine ​​kodieren, die an der Transkription, der Differenzierung von Muskelzellen und dem Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Weg beteiligt sind. Darüber hinaus fördert die Dehnung Veränderungen beim Spleißen von Kassetten-Exons und begünstigt den Exon-Einschluss gegenüber dem Überspringen. Diese Beweise legen nahe, dass RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) eine Rolle bei der Auslösung dieser Spleißänderungen als Reaktion auf die Zelldehnung spielen könnten.

Verschiedene Studien haben die Auswirkung von Dehnung auf Signalwege untersucht, aber unseres Wissens hat keine Studie einen unvoreingenommenen und globalen Ansatz verwendet, um zu definieren, wie sich Dehnung auf die Genexpression und alternative Spleißprogramme in Skelettmuskelzellen auswirkt. Um diese Wissenslücke zu schließen, nutzten wir das Flexcell-System, um über verschiedene Zeiträume (1 Stunde, 3 Stunden und 6 Stunden) mechanische Kräfte auf Muskelzellen auszuüben, und führten dann tiefgreifende RNA-Seq-Studien durch.

Wir haben uns dafür entschieden, unsere Studie in zwei verschiedenen Stadien der Muskelzelldifferenzierung (Myogenese) durchzuführen, um zu bestimmen, wie sich Dehnung auf die transkriptionellen und posttranskriptionellen Programme auswirkt, die für diese Stadien einzigartig sind. Während der Entwicklung reift im Muskel die intrazelluläre Architektur heran, die für eine ordnungsgemäße Kontraktion im Erwachsenenalter erforderlich ist. Myoblasten sind undifferenzierte Muskelzellen, die die frühe Muskelentwicklung oder krankheitsbedingt verkümmerte Muskeln nachahmen; während differenzierte Muskelzellen eher normale und erwachsenere Muskeln nachahmen. Bemerkenswert ist, dass die Differenzierung von C2C12-Myoblasten in mehrkernige Myotubes in Kultur die transkriptionellen und posttranskriptionellen Übergänge reproduziert, die während der Skelettmuskelentwicklung in vivo beobachtet wurden2,18,19, was diese Zellen als gutes Zellkulturmodell für das Verständnis der Mechanotransduktion etabliert18,19,20. Wir haben undifferenzierte Zellen (Myoblasten) und Zellen nach vier Tagen Differenzierung (differenzierte Zellen) gestreckt.

Die meisten Zelldehnungssysteme können mechanische Spannung nur in eine Richtung ausüben, was kein genaues Modell für die Kontraktion der Skelettmuskulatur darstellt. Während der Kontraktion erzeugt der Skelettmuskel Kraft über die Muskelfasern, indem er die Kraft sowohl seitlich als auch in Längsrichtung überträgt21. Das Flexcell-System, das wir hier verwendet haben, war einzigartig, da es Zellen auf zyklische, gleichbiaxiale Weise streckte, was ein weithin akzeptiertes Modell der in vivo-Skelettmuskelkraftübertragung22,23,24 ist. Die Dauer der Dehnung der Zellen wurde auf der Grundlage früherer Studien25 ausgewählt, um eine akute Reaktion (1 Stunde), eine mittlere Reaktion (3 Stunden) und eine anhaltende Reaktion (6 Stunden) auf die Dehnung zu untersuchen. Wir haben die Zellen mit der mit unserem System maximal möglichen Menge (16 %) gedehnt, was einem Druck von –69,5 (kPa) und einer Belastung von 0,16 entspricht, die auf die flexible Membran ausgeübt wird, auf der die Zellen ausplattiert wurden.

Nach der Sequenzierung erhielten wir einen Bereich von 63–103 Millionen Lesepaaren pro Probe, von denen mehr als 90 % dem mm10-Mausgenom zugeordnet waren (Ergänzungsdaten 1). Die hohe Kartierungsrate weist auf eine angemessene Qualität unserer Sequenzierungsdaten hin. Wir haben zunächst bestätigt, dass mehrere Myogenesemarker in den Myoblastenproben nicht exprimiert wurden und in den differenzierten Zellen stark induziert wurden (ergänzende Abbildung 1). Als nächstes führten wir eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durch, um Proben basierend auf der Genexpression sowohl für Myoblasten (Abb. 1a) als auch für differenzierte Zellen (Abb. 1b) zu gruppieren. Die nicht gestreckten Myoblasten trennten sich zusammen mit zwei unterschiedlichen Subclustern für die 1 h gestreckten Proben und die 6 h gestreckten Proben (Abb. 1a, dunkelgrün bzw. dunkelblau). Die 3 Stunden lang gestreckten Myoblasten trennten sich näher an den nicht gedehnten Proben (Abb. 1a, dunkelviolett). In den differenzierten Zellen trennten sich alle nicht gedehnten Proben, und wir beobachteten drei unterschiedliche Gruppen für die verschiedenen Streckungszeitpunkte, was zeigt, dass unterschiedliche Streckungszeiten zu deutlichen Veränderungen der Genexpression führten (Abb. 1b, dunkelgrün, dunkelviolett und dunkel). Blau). Eine der 1 Stunde gestreckten Proben trennte sich nicht eng von den anderen Replikaten, blieb ihnen aber ähnlicher als den Proben zu anderen Zeitpunkten. Diese Probe bestand andere Qualitätskontrollen und wurde daher zusammen mit allen Proben in die in den Ergebnissen beschriebene Analyse einbezogen. Es wurden Post-hoc-Tests unter Ausschluss dieser Stichprobe durchgeführt, die die Schlussfolgerungen der Studie nicht veränderten.

a, b Hauptkomponentenanalyse-Diagramme (PCA) von Myoblasten und differenzierten Zellen. CD. Die globale Genexpression ändert sich nach 1-stündiger, 3-stündiger oder 6-stündiger Dehnung von Myoblasten und differenzierten Zellen. Genexpressionsänderungen wurden durch Vergleich gestreckter und nicht gestreckter Proben berechnet. Gene galten als unterschiedlich exprimiert, wenn der angepasste p-Wert <0,05 und die Faltungsänderung > 1,50 (hochreguliert, nach oben) oder die Faltungsänderung < –1,50 (herunterreguliert, nach unten) war. e, f. Korrelationsdiagramm zwischen den durch qPCR-Assays gemessenen Genexpressionsänderungen (ausgedrückt als log2foldchange) und denen, die in den RNA-seq-Studien in Myoblasten und differenzierten Zellen beobachtet wurden. Die qPCR-Diagramme für die einzelnen Gene, die in den Korrelationsdiagrammen enthalten sind, sind in der ergänzenden Abbildung 2 (Myoblasten) und der ergänzenden Abbildung 3 (differenzierte Zellen) dargestellt.

In Myoblasten waren nach 1 Stunde bzw. 3 Stunden Dehnung im Vergleich zu nicht gedehnten Zellen 151 und 134 Gene herunterreguliert, während zu diesen Zeitpunkten nur wenige Gene (37 bzw. 46) hochreguliert waren (Abb. 1c). , links). Nach 6 Stunden Dehnung fanden wir im Vergleich zu nicht gedehnten Proben 158 hochregulierte Gene, während 102 Gene herunterreguliert waren (Abb. 1c, rechts). In differenzierten Zellen wurden im Vergleich zu nicht gedehnten Proben 54 bzw. 98 Gene als Reaktion auf eine einstündige bzw. dreistündige Dehnung herunterreguliert. Für die gestreckten, differenzierten Zellen wurden mehrere Gene (44 und 107) nach 1 bzw. 3 Stunden Dehnung hochreguliert (Abb. 1d, links). Nach 6 Stunden Dehnung fanden wir im Vergleich zu den nicht gedehnten Proben 188 herunterregulierte Gene, während 67 Gene hochreguliert waren (Abb. 1d, rechts). Insgesamt löste eine Dehnung über 1 und 3 Stunden sowohl bei Myoblasten als auch bei differenzierten Zellen ähnlichere Veränderungen in der Genexpression aus als eine Dehnung über 6 Stunden.

Wir validierten Genexpressionsänderungen als Reaktion auf Dehnung mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) in Myoblasten (ergänzende Abbildung 2) und differenzierten Zellen (ergänzende Abbildung 3). Wir haben Gene zur Validierung mit einer Faltungsänderung >1,5 für hochregulierte Gene und einer Faltungsänderung <–1,5 für herunterregulierte Gene und einem angepassten p-Wert <0,05 ausgewählt. Zwei der Gene, die sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen untersucht wurden, waren der Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf) und der cysteinreiche angiogene Induktor 61 (Cyr61), beides gut etablierte mechanosensitive Gene26,27,28. Ctgf- und Cyr61-mRNAs wurden nach einstündiger Dehnung in Myoblasten und nach ein- und dreistündiger Dehnung in differenzierten Zellen hochreguliert, was auf eine erfolgreiche Zelldehnung hinweist (ergänzende Abbildungen 2, 3). Nach 6-stündiger Dehnung waren Ctgf- und Cyr61-mRNAs weder in Myoblasten noch in differenzierten Zellen hochreguliert (ergänzende Abbildungen 2, 3), was darauf hindeutet, dass sich die Zellen an den zuvor berichteten langen mechanischen Reiz gewöhnen 28 .

Es wurde ein Korrelationsdiagramm erstellt, um die in den RNA-seq-Studien festgestellten mRNA-Expressionsänderungen mit denen zu vergleichen, die durch qPCR-Assays gemessen wurden. Wir beobachteten eine starke Korrelation zwischen den beiden Ansätzen sowohl bei Myoblasten (Pearson = 0,97, Abb. 1e) als auch bei differenzierten Zellen (Pearson = 0,94, Abb. 1f). Diese robuste Validierung bestätigt die hohe Qualität unserer RNA-seq-Daten.

Als nächstes fragten wir, ob die Gene, die zu verschiedenen Zeitpunkten der Dehnung hoch- oder herunterreguliert wurden, funktionell miteinander verbunden seien. Um diese Frage zu beantworten, führten wir eine Genontologieanalyse (GO) mithilfe der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) durch. Bei Myoblasten kodierten die Gene, die auf eine 1-stündige und 3-stündige Dehnung reagierten, für Proteine, die an der Transkriptionsregulation und der Differenzierung von Muskelzellen beteiligt sind, während bei Genen, die auf eine längere Dehnungsperiode (6 Stunden) reagierten, Kategorien im Zusammenhang mit der Proteinfaltung erkennbar waren (ergänzende Abbildung). . 4a). In differenzierten Zellen kodierten Gene, die auf Dehnung reagierten, für Proteine, die an der Muskelfunktion, der Transkription und dem Signalweg des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) (1 Stunde) und der Steroidhomöostase (3 Stunden und 6 Stunden) beteiligt sind (ergänzende Abbildung 4b). . Sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen kodierten Gene, die auf kürzere Dehnungszeiten reagierten, tendenziell für Proteine, die bei der Transkriptionsregulation und Muskeldifferenzierung eine Rolle spielen. Insgesamt zeigen unsere Daten auf unvoreingenommene Weise, dass die mechanische Dehnung von Skelettmuskelzellen deutliche, globale mRNA-Expressionsänderungen in Genen hervorruft, die für Proteine ​​kodieren, die an der Zelldifferenzierung und Transkriptionsregulation beteiligt sind.

Da mechanische Kräfte auf die Plasmamembran der Zelle einwirken, waren wir daran interessiert, die spezifischen intrazellulären Signalwege zu identifizieren, die als Reaktion auf die Dehnung aktiviert werden. Um dies zu untersuchen, führten wir eine DAVID-Signalweganalyse der Gene durch, die auf eine ein- oder dreistündige Dehnung in differenzierten Zellen reagierten. Nach einer Stunde Dehnung wurden die reagierenden Gene auf Signalwegen angereichert, darunter die MAPK-Kaskade, die Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (ErBβ), der Janus-Kinase-Signalwandler und Aktivator der Transkription (JAK/STAT) und der Tumornekrosefaktor (TNF). ) Signalisierung (Abb. 2a). In den Proben, die 3 Stunden lang gedehnt wurden, wurden nur wenige Pfade angereichert. Interessanterweise kodierten zahlreiche hochregulierte Gene nach einer Stunde Dehnung für Proteine, die Teil der Kaskade der extrazellulären signalbezogenen Kinase (ERK1/2) sind, die sich am Schnittpunkt der MAPK-, ErBβ- und JAK/STAT-Achsen befindet. Die ERK1/2-Phosphorylierung wurde während der C2C12-Zelldifferenzierung drastisch verringert, während sich die gesamten ERK1/2-Proteinspiegel nicht veränderten (ergänzende Abbildung 5). Interessanterweise wurden ERK1/2 als Reaktion auf eine ein- und dreistündige Zelldehnung in differenzierten Zellen signifikant phosphoryliert (Abb. 2b). Es wurde zuvor gezeigt, dass ERK1/2 als Reaktion auf einen Dehnungsreiz im Skelettmuskel von Mäusen und Ratten sowie in C2C12-Zellen phosphoryliert werden, sodass unsere Daten frühere Arbeiten bestätigen29,30,31.

Eine Pathway-Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene als Reaktion auf die Dehnung in differenzierten Zellen wurde mit DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) durchgeführt. Rote Linien zeigen p-Werte <0,05 an. b Differenzierte Muskelzellen wurden 1 oder 3 Stunden lang gedehnt. Western-Blot-Assays wurden durchgeführt und durch Densitometrie quantifiziert, um die Gesamt-ERK1/2- und phosphorylierten ERK1/2-Spiegel (p-ERK1/2) zu untersuchen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, N = 3, *p < 0,05, Welch-T-Test angezeigt. c mRNA-Expressionsänderungen verschiedener Gene, die Proteine ​​kodieren, die an mit ERK1/2 verknüpften Signalwegen beteiligt sind, unter Verwendung von RNA-seq-Daten (differenzierte Zellen). Die Faltenveränderung wurde als Verhältnis zwischen gestreckten und nicht gestreckten Proben definiert. Werte über 1 weisen auf hochregulierte Gene hin, Werte unter 1 auf herunterregulierte Gene. d Cartoon, der die durch Zelldehnung aktivierten Gene zeigt, um zu veranschaulichen, wie der MAPK-Signalweg aktiviert werden kann. nein: ungedehnte Proben. s: gestreckte Proben.

Um die Auswirkung der Dehnung auf die MAPK-Signalübertragung weiter zu definieren, haben wir anhand unserer RNA-seq-Daten die Aktivierung verschiedener MAPK-Ziele untersucht. Zahlreiche Gene in diesem Signalweg waren nach 1 Stunde Zelldehnung hochreguliert und nach 3 Stunden Zelldehnung leicht hochreguliert (Abb. 2c). Darüber hinaus bestätigten wir bei der Validierung einiger dieser Ziele durch qPCR-Assays die signifikante Hochregulierung (ergänzende Abbildung 3, Myc und Ctgf). Insgesamt führten diese Beweise zu dem Schluss, dass eine kurze Dehnung (1 Stunde) die MAPK-Achse aktiviert, um die Transkription von Genen zu induzieren, die für Proteine ​​kodieren, die an der Signaltransduktion und Transkriptionsaktivierung anderer Gene beteiligt sind (Abb. 2d).

Da die ERK1/2-Phosphorylierung mechanosensitiv war, wollten wir herausfinden, ob dieser Weg eine Rolle bei der Aktivierung der Transkription von Genen beim Dehnen spielt. Dazu verwendeten wir einen bewährten ERK1/2-Phosphorylierungsinhibitor (U0126) und streckten differenzierte Zellen 1 Stunde lang (mit oder ohne Inhibitor). Wir haben diese Streckungszeit gewählt, da die stärkste ERK1/2-Phosphorylierung nach 1 Stunde Streckung auftrat (Abb. 2b). Zunächst bestätigten wir die vollständige Hemmung der ERK1/2-Phosphorylierung sowohl in den ungedehnten als auch in den gestreckten Zellen nach der Behandlung mit U0126 (Abb. 3a). Als nächstes untersuchten wir die mRNA-Expressionsniveaus mehrerer mechanosensitiver Gene, die Teil des MAPK-Signalwegs sind. Bei mehreren dieser Gene hob U0126 die Reaktion auf Dehnung auf (Abb. 3b, Nr4a1, Atf3 und Ccl2), was darauf hindeutet, dass ERK1/2 eine Rolle bei ihrer Aktivierung beim Dehnen spielt. Bei einigen anderen Genen wurde die Reaktion auf Dehnung in Gegenwart von U0126 teilweise aufgehoben (Abb. 3b, Ctgf, Cyr61, Fos, Myc und Ereg), was darauf hindeutet, dass ERK1/2 möglicherweise nicht der einzige Aktivator dieser Ziele bei Dehnung ist , kann aber dazu beitragen, ihre Aktivierung aufrechtzuerhalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hemmung der ERK1/2-Phosphorylierung einige mechanosensitive Gene beeinflusste, was auf eine Rolle dieses Signalwegs bei der Dehnungsreaktion differenzierter Zellen hinweist.

a Differenzierte Muskelzellen wurden mit dem ERK1/2-Phosphorylierungsinhibitor U0126 behandelt und 1 Stunde lang gedehnt. Western-Blot-Assays wurden durchgeführt und durch Densitometrie quantifiziert, um die Gesamt-ERK1/2- und phosphorylierten ERK1/2-Spiegel (p-ERK1/2) zu untersuchen. b qPCR-Assays wurden durchgeführt und quantifiziert, um die mRNA-Expressionsänderungen von acht mechanosensitiven Genen zu untersuchen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, N = 3 angezeigt. *p < 0,05, einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Post-hoc-Mehrfachvergleichstest.

Die RNA-Verarbeitung kann durch mehrere Faktoren reguliert werden, darunter Transkriptionsgeschwindigkeit, Temperatur, zellulärer Stress und andere Umweltfaktoren32,33,34. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass mechanisches Dehnen alternative Spleißänderungen in Skelettmuskelzellen hervorruft.

Um die Verteilung der alternativ gespleißten Ereignisse zu untersuchen, die auf Dehnung reagierten, verwendeten wir die Software Mixture of Isoforms (MISO)35. MISO ermöglicht die genaue Bestimmung alternativer Spleißmuster auf Exon-Ebene. Wir haben die Änderung der prozentualen Spleißung (ΔPSI) als Differenz zwischen dem PSI unter Streckbedingungen und dem PSI bei nicht gedehnten Proben (PSIstretch–PSIno-Streckung) definiert36. Ereignisse wurden als differenziell gespleißt betrachtet, wenn der Wilcox-p-Wert ≤ 0,05 und | ΔPSI | > 10. Bei Myoblasten beobachteten wir einen Anstieg der Gesamtzahl der Spleißereignisse, wenn die Zellen über längere Zeiträume gedehnt wurden (Abb. 4a, links). Während in differenzierten Zellen die Gesamtzahl der Spleißereignisse von 1 Stunde auf 3 Stunden anstieg und von 3 Stunden auf 6 Stunden leicht abnahm (Abb. 4a, rechts).

a Anzahl alternativer Spleißereignisse nach 1 Stunde, 3 Stunden und 6 Stunden Dehnung von Myoblasten (links) und differenzierten Zellen (rechts), identifiziert durch RNA-seq-Experimente. b, c Diagramme der Hauptkomponentenanalyse (PCA) der alternativen Spleißänderungen als Reaktion auf die Dehnung in Myoblasten und differenzierten Zellen. d, e. Korrelationsdiagramme von ΔPSI-Werten aus RNA-seq-Studien im Vergleich zu ΔPSI-Werten aus RT-PCR-Experimenten in Myoblasten und differenzierten Zellen. N = 4 in Myoblasten und N = 4–5 in differenzierten Zellen. RT-PCR-Gele, die die in den Korrelationsdiagrammen enthaltenen Daten erzeugen, sind in der ergänzenden Abbildung 6 (Myoblasten) und der ergänzenden Abbildung 7 (differenzierte Zellen) dargestellt. Alternative Regionen wurden als differenziell gespleißt betrachtet, wenn | ΔPSI | > 10 zwischen gedehnten und nicht gedehnten Proben. Der ΔPSI wurde als Differenz zwischen dem PSI in gedehnten Proben und dem PSI in den nicht gedehnten Kontrollen definiert. PSI-Prozent eingefügt.

Die PCA-Analyse ergab Korrelationen zwischen den alternativen Spleißereignissen über zunehmende Dehnungszeiten hinweg. Bei Myoblasten beobachteten wir eine deutliche Segregation für die 1-, 3- und 6-Stunden-gestreckten Proben (Abb. 4b, dunkelgrün, dunkelviolett bzw. dunkelblau) und eine deutliche Segregation der nicht gedehnten Proben. In ähnlicher Weise trennten sich die nicht gestreckten differenzierten Zellen, und die 1 h, 3 h und 6 h gestreckten Proben wiesen eindeutige Gruppen auf (Abb. 4c, dunkelgrün, dunkelviolett bzw. dunkelblau). Diese Daten führten uns zu dem Schluss, dass die Dehnung zu jedem Zeitpunkt deutliche Änderungen beim alternativen Spleißen hervorruft.

Um die durch RNA-seq als Reaktion auf die Dehnung erkannten Spleißübergänge zu validieren, führten wir eine Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR)-Analyse von 12 Kassetten-Exons in Myoblasten (ergänzende Abbildung 6) und 11 Kassetten-Exons in differenzierten Zellen (ergänzende Abbildung 7) durch ). Einige dieser Ereignisse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht, da RNA-seq-Daten zeigten, dass sie zu unterschiedlichen Zeiten auf Dehnung reagierten. Wir beobachteten eine starke Korrelation (Pearson = 0,82 in Myoblasten und Pearson = 0,84 in differenzierten Zellen) zwischen den ΔPSI-Werten aus RNA-seq und denen aus RT-PCR-Experimenten (Abb. 4d, e).

Insgesamt kommen wir zu dem Schluss, dass unsere RNA-seq-Studie hoch reproduzierbare und robuste Daten lieferte und dass zahlreiche Spleißereignisse in Muskelzellen mechanosensitiv sind.

Es gibt verschiedene Arten von Spleißereignissen, darunter Kassetten-Exons, sich gegenseitig ausschließende Exons, zurückgehaltene Introns, alternative 3'-Spleißstellen und alternative 5'-Spleißstellen (Abb. 5a). Wir haben daher gefragt, ob es einen Typ von Spleißereignis gibt, der häufiger vorkommt, und inwieweit sich die Verteilung der Spleißereignistypen im Laufe der Dehnungszeit verändert. Zunächst beobachteten wir, dass >44 % der Spleißereignisse zu allen Zeitpunkten Kassetten-Exons waren (Abb. 5b). Zweitens stellten wir fest, dass mit der Streckung der Zellen der Anteil der alternativ gespleißten Kassetten-Exons mit der Zeit zunahm, während der Anteil der zurückgehaltenen Introns abnahm (mit Ausnahme des Übergangs von 3 Stunden auf 6 Stunden in differenzierten Zellen) (Abb. 5b). Wir haben den Rest unserer Analyse auf Kassetten-Exons konzentriert, da diese die häufigste Art von Spleißereignissen waren.

ein Schema, das die verschiedenen Arten von Spleißereignissen zeigt. b Verteilung der Spleißereignisse je nach Typ in Myoblasten (oben) und differenzierten Zellen (unten). Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Spleißereignisse an. c Dichtediagramme der Kassetten-Exonlänge in Myoblasten (oben) und differenzierten Zellen (unten). Die Art(en) der Kassetten-Exonlänge werden neben jedem Diagramm angezeigt. d Anteil der Kassetten-Exons, die in Myoblasten (oben) und differenzierten Zellen (unten) unteilbar durch drei (lila) oder durch drei teilbar (blau) sind. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Spleißereignisse an. e Anteil der Spleißereignisse, bei denen es beim Strecken zu einem stärkeren Einschluss (ΔPSI > 10, blau) oder stärkeren Ausschluss (ΔPSI < −10, rot) der alternativ gespleißten Region kam. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Spleißereignisse an. Der ΔPSI wurde als Differenz zwischen dem PSI in gedehnten Proben und dem PSI in den nicht gedehnten Kontrollen definiert. PSI-Prozent eingefügt.

Als nächstes fragten wir, ob die Dehnung Veränderungen in der Verteilung und Art der Kassetten-Exonlänge hervorrief. Der Modus variierte bei den Myoblasten stärker als bei den differenzierten Zellen. Über alle drei Zeitpunkte hinweg gab es jedoch eine ähnliche Verteilung der Kassetten-Exonlänge sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass die Kassetten-Exonlänge nicht empfindlich auf Dehnung reagiert.

Durch drei teilbare Kassetten-Exons können der Proteinsequenz ein Peptid hinzufügen oder das Potenzial haben, ein Stoppcodon hinzuzufügen. Dagegen können durch drei unteilbare Kassetten-Exons den Leserahmen unterbrechen, was häufig zu einem verkürzten Protein oder einem Protein mit einem anderen C-Terminus führt. Auf diese Weise haben wir den Anteil der Exons bestimmt, die empfindlich auf Dehnung reagierten und durch drei teilbar oder unteilbar waren. In Myoblasten waren 48 % der Kassetten-Exons, die auf eine einstündige Dehnung reagierten, durch drei teilbar, 61 % und 50 % der Exons, die auf eine drei- oder sechsstündige Dehnung reagierten, waren ebenfalls durch drei teilbar (Abb. 5d, Spitze). Dies weist darauf hin, dass Myoblasten nach 3 Stunden Dehnung möglicherweise etwas weniger verkürzte oder möglicherweise rahmenverschobene Proteine ​​aufweisen. Umgekehrt hatten in differenzierten Zellen alle drei Zeitpunkte einen ähnlichen Anteil an Kassetten-Exons, die empfindlich auf Dehnung reagierten und durch drei teilbar waren: 48 % (1 h), 45 % (3 h) und 43 % (6 h) (Abb. 5d). , unten).

Wir haben dann gefragt, ob das Dehnen zu mehr Überspringen oder mehr Einbeziehung der alternativ gespleißten Regionen führt. In Myoblasten steigt der Anteil der Ereignisse mit ΔPSI > 10 (Dehnung führt zum Einschluss) mit der Dehnungszeit (ergänzende Abbildung 8a, links). In differenzierten Zellen beobachteten wir einen drastischeren Trend in die gleiche Richtung (ergänzende Abbildung 8a, rechts). Da wir den Großteil unserer Analyse auf Kassetten-Exons konzentrierten, stellten wir auch fest, ob die Dehnung zu mehr Überspringen oder Einschluss speziell von Kassetten-Exons führte. In Myoblasten steigt der Anteil der Kassetten-Exons mit ΔPSI <–10 (Dehnung führt zum Ausschluss) über die Dehnungszeit leicht an (Abb. 5e, oben). In differenzierten Zellen beobachteten wir einen gegenteiligen Trend, wobei längere Dehnungszeiten zu einem stärkeren Einschluss von Kassetten-Exons führten (Abb. 5e, unten).

Als nächstes führten wir eine GO-Analyse durch, um zu bestimmen, ob Gene, die alternativ gespleißte Kassetten-Exons enthalten, die durch Zelldehnung reguliert werden, funktionell verwandt sind. In Myoblasten wurden Kategorien im Zusammenhang mit der Transkriptionsregulation (1 h, 3 h, 6 h) und DNA-Schäden sowie Phosphorylierung (3 h und 6 h) angereichert (ergänzende Abbildung 8b). Als wir in differenzierten Zellen die alternativ gespleißten Gene beim Strecken analysierten, beobachteten wir eine Anreicherung in Kategorien im Zusammenhang mit der Transkriptionsregulation (1 h und 6 h), der Phosphorylierung (1 h, 3 h, 6 h) und der DNA-Schädigung (6 h). ) (Ergänzende Abbildung 8c). Gene, die Kassetten-Exons enthielten, die zu jedem Zeitpunkt in Myoblasten und für 6 Stunden in differenzierten Zellen auf Dehnung reagierten, wurden hinsichtlich DNA-Schadenskategorien angereichert. Dies deutet darauf hin, dass die Dehnung differenzierter Zellen über einen längeren Zeitraum zu Schäden führen kann.

Myoblasten und differenzierte Zellen unterliegen unterschiedlichen mechanischen Umgebungen, wir haben jedoch die Hypothese aufgestellt, dass einige Gene unabhängig vom Differenzierungsstatus mechanosensitiv sein könnten. Um dies zu untersuchen, überlappten wir die mechanosensitiven Gene sowohl auf der Transkriptionsebene (Genexpression) als auch auf der Spleißebene zwischen Myoblasten und differenzierten Zellen zu jedem Zeitpunkt nach der Dehnung. Wir fanden heraus, dass Myoblasten und differenzierte Zellen nach einer Stunde Dehnung zahlreiche mechanosensitive Gene (57 Gene) gemeinsam hatten; Diese Überlappung nahm ab, je länger die Zellen gedehnt wurden (37 Gene für 3 Stunden Dehnung und 43 Gene für 6 Stunden Dehnung) (ergänzende Abbildung 9a). Insgesamt gab es nur wenige Gene, die alternativ gespleißt wurden und zu irgendeinem Zeitpunkt zwischen Myoblasten und differenzierten Zellen überlappten (12–19 Gene). Eine weitere Untersuchung der mechanosensitiven Gene sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen nach einstündiger Dehnung ergab, dass mehrere von ihnen am MAPK-Signalweg beteiligt waren (ergänzende Abbildung 9b, grün). Es wurde bestätigt, dass Nr4a1, Atf3, Ctgf und Fos auf die Hemmung der ERK1/2-Phosphorylierung reagieren, was darauf hindeutet, dass ERK1/2 tatsächlich an der Regulierung ihrer Reaktion auf Dehnung beteiligt ist (Abb. 3b).

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Spleißänderungen zur Expression unterschiedlicher Proteinisoformen führen, im Gegensatz zu Variationen bei Veränderungen der gesamten Genexpressionsniveaus37,38,39. Um dies zu untersuchen, überlappten wir die mechanosensitiven Gene auf der Ebene der Transkription (Genexpression), wobei die Gene ihre alternativen Spleißmuster als Reaktion auf die Dehnung zu jedem Zeitpunkt änderten (ergänzende Abbildung 10). Wir fanden heraus, dass es eine minimale Überlappung zwischen den mechanosensitiven Genen mit veränderter Transkription und solchen mit veränderten Spleißmustern gab. Daher sind Transkriptionsänderungen und Spleißvariationen aufgrund der Zelldehnung an unterschiedlichen zellulären Prozessen beteiligt und voneinander unabhängig.

Da längere Dehnungsperioden zu einem stärkeren Exon-Einschluss in differenzierten Zellen führten, stellten wir die Hypothese auf, dass Veränderungen in der Expression, Translation oder der Aktivität spezifischer Spleißfaktoren an der Förderung des Exon-Einschlusses beteiligt sein könnten. Um dies zu bewerten, haben wir anhand unserer RNA-seq-Daten die Auswirkung der Dehnung differenzierter Muskelzellen auf die mRNA-Expressionsniveaus von RBPs bestimmt. Insgesamt beobachteten wir, dass die Gruppe der RBPs, die stärkere Veränderungen aufwiesen, die Serin- und Arginin-reichen (SR) Proteine ​​waren. In Eukaryoten gibt es 12 SR-Proteine ​​(mit den Namen SRSF1 bis SRSF12), die das alternative Spleißen und die Genexpression regulieren40. Diese Proteine ​​haben zahlreiche Funktionen in der Zelle, sind jedoch vor allem an der Spleißreaktion beteiligt41,42.

In unseren Studien haben wir beobachtet, dass SRSF2, SRSF5 und SRSF6 nach der Dehnung starke mRNA-Veränderungen aufwiesen (Abb. 6a). Im Gegensatz dazu werden andere RBPs, die häufig in Muskelzellen exprimiert werden, wie die CUGBP Elav-like Family Member (CELF)-Proteine, die Muscleblind Like Splicing Regulator (MBNL)-Proteine, die heterogenen nuklearen Ribonukleopartikel (HNRNP)-Proteine, das Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein 1 (PTBP1), Zittern (QKI) und das RNA-bindende Fox-1-Homolog 2 (RBFOX2) reagierten, wenn überhaupt, nur minimal auf die Zelldehnung (Abb. 6a).

a Veränderungen der Genexpression verschiedener RNA-bindender Proteine ​​(RBPs) bei Zelldehnung differenzierter Zellen. Die Faltenveränderung wurde als Verhältnis zwischen gestreckten und nicht gestreckten Proben definiert. Werte über 1 weisen auf hochregulierte Gene hin, Werte unter 1 auf herunterregulierte Gene. b Kreisdiagramme, die die Überlappung zwischen Genen zeigen, die auf die Überexpression von SR-Proteinen auf Transkriptionsebene reagieren43, und Genen, die auf Zelldehnung reagieren. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Gene an. c Kreisdiagramme, die die Überlappung zwischen Genen mit alternativen Kassetten-Exons, die auf eine Überexpression des SR-Proteins reagieren43, und Genen mit alternativen Kassetten-Exons, die auf Zelldehnung (Spleißniveau) reagieren, zeigen. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der Gene an.

SR-Proteine ​​werden durch Phosphorylierung aktiviert40 und die Phosphorylierung von SR-Proteinen könnte wahrscheinlich zur Mechanotransduktion beitragen; unseres Wissens nach gibt es jedoch keine Studien, die diese Hypothese überprüft haben. Wir untersuchten daher, ob eines der Gene, die auf Dehnung reagierten (transkriptionell oder auf der Spleißebene), bekannte Ziele der Proteine ​​der SR-Familie waren. Um dies zu untersuchen, verwendeten wir eine frühere RNA-seq-Studie, die die Gene und Spleißereignisse identifizierte, die auf die Überexpression von SRSF2, SRSF4, SRSF6 oder SRSF9 in MCF-10A-Zellen reagieren43. Wir haben die Überlappung zwischen den Genen bestimmt, die auf die Überexpression des SR-Proteins reagierten (auf Transkriptions- und Spleißebene) und denen, die in unseren differenzierten Muskelzellen mechanosensitiv waren (alle Zeitpunkte). Ungefähr 18 % der Gene, die auf Dehnung reagierten, überlappten mit den Genen, die auf SRSF4-Überexpression reagierten, während die Prozentsätze bei anderen SR-Proteinen niedriger waren (Abb. 6b). Interessanterweise überlappten 20 % und 21 % der auf Dehnung reagierenden Gene auf den Spleißebenen (Kassetten-Exons) mit denen, die auf die Überexpression von SRSF4 bzw. SRSF6 reagierten (Abb. 6c). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die Dehnung von Zellen sowohl transkriptionelle als auch posttranskriptionelle Veränderungen induziert, die möglicherweise durch SRSF4 in unserem System reguliert werden.

Die Aktivierung von SR-Proteinen erfolgt durch Phosphorylierung. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass Dehnung Phosphorylierungsänderungen in den SR-Proteinen hervorrufen kann. Wir haben einige der SR-Proteine ​​erforscht und ihren Phosphorylierungsstatus in differenzierten Muskelzellen untersucht. Wie oben beschrieben, traten in Genen, die für Proteine ​​kodieren, die an der DNA-Schadensreaktion beteiligt sind, Spleißänderungen auf, die auf eine Dehnung von 6 Stunden reagierten (ergänzende Abbildung 8c), was darauf hindeutet, dass längere Dehnungsperioden eine Stressreaktion auslösen könnten und möglicherweise zu lang sind Reiz für unsere Zellen. Darüber hinaus zeigten Ctgf und Cyr61 nach 6 Stunden in differenzierten Zellen keine signifikante Hochregulierung, was darauf hindeutet, dass sich die Zellen an den Dehnungsreiz angepasst hatten. Daher haben wir uns entschieden, nur die 1-Stunden- und 3-Stunden-Zeitpunkte zu analysieren.

Wir haben die Gesamtproteingehalte einiger SR-Proteine ​​​​und ihren Phosphorylierungsgrad durch Western Blot bewertet. Interessanterweise beobachteten wir Unterschiede in den Mengen an phosphoryliertem SRSF4 zwischen gestreckten und nicht gestreckten Zellen (Abb. 7a), obwohl die Srsf4-mRNA-Expression nicht auf die Streckung reagierte (Abb. 6a). Nach einer Stunde Dehnung war das SRSF4-Gesamtprotein leicht hochreguliert, sein Phosphorylierungsgrad war jedoch deutlich verringert (Abb. 7a). Das SRSF4-Gesamtprotein wurde als Reaktion auf eine dreistündige Dehnung leicht hochreguliert, was mit einem entsprechenden Anstieg seiner Phosphorylierung einherging (Abb. 7a). Wir beobachteten keine Veränderung des SRSF5-Gesamtproteins oder der Phosphorylierung nach dem Dehnen (Abb. 7b), obwohl das Dehnen eine Veränderung seiner mRNA-Spiegel hervorrief. Die Srsf6-mRNA-Expression und das SRSF6-Gesamtprotein waren nach 3-stündiger Dehnung leicht hochreguliert, was mit einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierungsniveaus einherging (Abb. 7c).

Differenzierte Muskelzellen wurden 1 oder 3 Stunden lang gedehnt und Western-Blot-Assays wurden durchgeführt und durch Densitometrie quantifiziert, um die Gesamt- und Phosphorylierungswerte von SRSF4 (a), SRSF5 (b) und SRSF6 (c) zu untersuchen. nein: ungedehnte Proben. s: gestreckte Proben. d Einige überlappende Gene und Spleißereignisse aus den in Abb. 6c gezeigten SRSF4-Kreisdiagrammen wurden in Cartoons für Dehnungszeitpunkte von 1 Stunde und 3 Stunden dargestellt, um zu zeigen, wie mechanosensitive Ziele und solche, die durch SRSF4 reguliert werden, eine Rolle in der MAPK-Signalkaskade spielen könnten. ATF3 aktivierender Transkriptionsfaktor 3, AREG-Amphiregulin, BMF Bcl2 modifizierender Faktor, CYR61 Cystein-reicher angiogener Induktor 61, CYP1A1 Cytochrom p450 Familie 1 Unterfamilie A Mitglied 1, CTGF Bindegewebswachstumsfaktor, DDR1 Discoidindomänenrezeptor-Tyrosinkinase 1, DUSP1 Dual-Spezifitäts-Phosphatase 1, DUSP5-Phosphatase mit doppelter Spezifität 5, EGFR-Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor, extrazelluläre signalregulierte ERK-Kinase, EREG-Epiregulin, FGFR3-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 3, FHL2 viereinhalb LIM-Domänen 2, FOS Fos-Protoonkogen-AP-1-Transkriptionsfaktor Untereinheit, FOSL1 FOS wie 1 AP-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheit, GPR3 ​​G-Protein-gekoppelter Rezeptor 3, GPR39 G-Protein-gekoppelter Rezeptor 39, HBEGF-Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor, LATS große Tumorsuppressorkinase 1, JNK c-Jun N- terminale Kinase, MADD MAP Kinase aktivierende Todesdomäne, MEIS Meis Homöobox 1, MYC MYC Protoonkogen, NPR3 natriuretischer Peptidrezeptor 3, PBX3 PBX Homöobox 3, PIT1 Hypophysen-Transkriptfaktor 1, PLAU Plasminogenaktivator-Urokinase, PTPN22 Protein-Tyrosinphosphatase-Nichtrezeptor Typ 22, P38 p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase, RGS2-Regulator der G-Protein-Signalisierung 2, SQLE-Squalenepoxidase, TEAD4 TEA-Domänen-Transkriptionsfaktor 4, TIMP3 TIMP-Metallopeptidase-Inhibitor 3, YAP-Ja-assoziiertes Protein. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM, N = 4 (a), N = 4 (b), N = 4 (c) *p < 0,05, Welch-T-Test angezeigt.

Somit scheint die SRSF4-Phosphorylierung nach einer Stunde Dehnung mechanosensitiv zu sein, wohingegen eine längere Dehnungsperiode (3 Stunden) zu einem Anstieg des SRSF4-Gesamtproteins bei gleichzeitiger Zunahme seiner Phosphorylierung führte. Wir waren daran interessiert, die potenziellen Transkriptions- und Posttranskriptionsprogramme zu bestimmen, die SRSF4 steuerte, wenn Zellen gedehnt wurden. Um dies zu untersuchen, analysierten wir die überlappenden Gene und Spleißereignisse, die auf die Überexpression von SRSF443 und die Zelldehnung reagierten (1 h und 3 h) (Abb. 7d). Wir beobachteten, dass mehrere dieser überlappenden Gene Proteine ​​kodieren, die mit der MAPK-Signalkaskade verbunden sind (Abb. 7d). Diese Erkenntnisse veranlassten uns zu der Annahme, dass SRSF4 in Muskelzellen als mechanosensitives RBP fungieren könnte, das dabei hilft, transkriptionelle und posttranskriptionelle Programme als Reaktion auf die Dehnung durch den MAPK-Weg zu steuern.

Verschiedene Gruppen haben Muskelzellen mit unterschiedlichen Dehnungsamplituden und unterschiedlichen Zeitintervallen gedehnt, wie in25 beschrieben. Diese Studien kamen zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen: Einige behaupten, dass Dehnung die Proliferation von Muskelzellen induziert, andere behaupten, dass Dehnung die Differenzierung von Muskelzellen fördert25. Wir beobachteten sowohl eine Hochregulierung als auch eine Herunterregulierung spezifischer Differenzierungstranskriptionsfaktoren in Myoblasten. Myogenin ist ein wichtiger Treiber der Myogenese und wurde nach dem Dehnen herunterreguliert. Das FOS-Protoonkogen ist ein negativer Regulator von Myogenin und wurde nach einer Stunde Zelldehnung stark hochreguliert. Diese Hochregulierung legt nahe, dass FOS die Myogeninexpression herunterreguliert, um die Differenzierung von Muskelzellen zu verhindern. Umgekehrt ist der Transkriptionsfaktor Early Growth Response 1 (EGR1) ein positiver Regulator von Myogenin44, und die Egr1-mRNA wurde nach der Dehnung in unserer Studie hochreguliert. Da die Egr1-mRNA bei der Dehnung hochreguliert wird, ohne dass es zu einem entsprechenden Anstieg der Myogenin-Expression kommt, deutet dies darauf hin, dass FOS die Myogenin-Expression herunterreguliert, um die Myoblastendifferenzierung als Reaktion auf die Zelldehnung zu verhindern.

Frühere Studien haben eine Heterogenität von Myoblastenzellen festgestellt, von der angenommen wurde, dass sie zu ihren unterschiedlichen Reaktionen auf mechanische Reize beiträgt25,45. Unsere Daten stimmen mit dieser Hypothese überein, da wir Veränderungen sowohl bei den proliferations- als auch differenzierungsfördernden Transkriptionsfaktoren beobachtet haben, was darauf hindeutet, dass die heterogenen Myoblasten möglicherweise eine komplexe Reaktion auf mechanische Dehnung hervorrufen. Wenn die Skelettmuskulatur einem mechanischen Reiz ausgesetzt wird, erfolgt die Regeneration effektiver durch die Aktivierung der Satellitenzellen46. Daher könnte die Tatsache, dass die Zellheterogenität die Fähigkeit von Myoblasten beeinflusst, auf Dehnung zu reagieren, Auswirkungen auf die Regenerationsfähigkeit des Muskelgewebes haben47.

Eine kurzfristige Dehnung differenzierter Zellen führte zur Hochregulierung von Muskeldifferenzierungsgenen und einigen proliferationsassoziierten Genen. Proteine, die an der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt sind, überschneiden sich häufig, da während der Myogenese ein empfindliches Gleichgewicht der Transkriptionsprogramme besteht, das die Zellen entweder zur Proliferation oder zur Differenzierung antreibt48. Interessanterweise zeigten differenzierte Zellen zu jedem Dehnungszeitpunkt mRNA-Veränderungen in bestimmten Gruppen funktionell verwandter Gene, im Gegensatz zu einer längeren Zeit unter Dehnung, die zu einem größeren Ausmaß der Veränderung führte. Dies weist darauf hin, dass Muskelzellen eine genetische Umprogrammierung durchlaufen, wenn sie sich an mechanische Reize anpassen. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, in denen die wiederholte Dehnung von Skelettmuskelfasern den Fasertyp verändert, indem Genexpressionsprogramme als adaptiver Mechanismus als Reaktion auf mechanische Reize geändert werden49. Die Anpassung von Muskelzellen an die Dehnung erfolgt über verschiedene Signalwege50, was teilweise erklären könnte, warum es nach 1 Stunde Dehnung in differenzierten Zellen zu einzigartigeren Veränderungen der Genexpression kommt als nach 3 und 6 Stunden Dehnung, die insgesamt ähnlichere Transkriptionsübergänge aufweisen.

Aufgrund ihres einzigartigen mechanischen Kontexts haben wir uns entschieden, Myoblasten nicht direkt mit differenzierten Zellen zu vergleichen. Es war jedoch interessant, dass einige mechanosensitive Gene zwischen den einzelnen Zeitpunkten sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen überlappten. Dies legt nahe, dass einige mechanosensitive Gene auf Transkriptions- und Spleißebene unabhängig vom Differenzierungsstatus ähnlich auf mechanische Kraft reagieren und gute Kandidaten für zukünftige Experimente zur Untersuchung der Mechanotransduktion im Skelettmuskel sein könnten.

Obwohl bekannt ist, dass der MAPK-Signalweg in Maus- und Rattensystemen mechanosensitiv ist29,30,31, sind die molekularen Mechanismen, die diese Aktivierung steuern, und ihre funktionellen Auswirkungen noch unklar. Wir beobachteten, dass mehrere der hochregulierten Gene nach der Dehnung stromabwärts gelegene Ziele der MAPK-Kaskade waren und andere stromaufwärts gelegene Aktivatoren von MAPK waren, was auf eine potenzielle positive Rückkopplungsschleife zur Förderung einer konsistenten Aktivierung des Signalwegs hinweist. Darüber hinaus werden einige der mechanosensitiven Gene nach einer Stunde Dehnung (Myoblasten und differenzierte Zellen) durch den MAPK-Weg aktiviert. Fos ist ein Frühreaktionsgen, das als Reaktion auf körperliche Betätigung stark hochreguliert wird und an einer Vielzahl zellulärer Prozesse einschließlich der Transkription beteiligt ist51. Ctgf ist ein weiteres Frühreaktionsgen auf körperliche Betätigung und CTGF wird in Muskelfasern rekrutiert, um die Umgestaltung von Matrixproteinen zu fördern27. Die starke Aktivierung dieser beiden Gene nach einstündiger Dehnung sowohl in Myoblasten als auch in differenzierten Zellen lässt auf eine Rolle des MAPK-Signalwegs bei der Regulierung der Dehnungsreaktion durch Transkriptionsprogramme schließen. Interessanterweise zeigten mehrere MAPK-Ziele eine ablatierte Reaktion auf die Zelldehnung, wenn die ERK1/2-Phosphorylierung gehemmt wurde, was darauf hindeutet, dass MAPK tatsächlich an der Transkriptionsmodulation beteiligt ist.

Frühere Studien haben die Hypothese aufgestellt, dass die Verbindung der MAPK-Signalübertragung mit anderen Spleißfaktoren der Schlüssel zum Verständnis ist, wie alternatives Spleißen auf mechanische Kräfte reagiert29, dies wurde jedoch nicht bewiesen. Eine kürzlich an C. elegans durchgeführte Studie zeigte, dass der Verlust des Spleißfaktors MBNL1 zu einer verminderten Aktivität von MAPK führte, was sich auf nachgeschaltete Spleiß- und Genexpressionsprogramme auswirkte52. In unserer Studie deuten die Aktivierung von ERK1/2 beim Dehnen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf Transkriptionsziele darauf hin, dass der MAPK-Weg mit anderen Spleißfaktoren interagieren könnte, um diese Veränderungen zu verursachen.

Das Dehnen der Zellen über 1 Stunde und 3 Stunden führte zu einem Anstieg der Gesamtzahl der Spleißereignisse in differenzierten Muskelzellen sowie zu einer Verschiebung hin zu mehr Exon-Einschluss statt Ausschluss. SR-Proteine ​​sind bekannte Promotoren des Exon-Einschlusses53,54. Unsere RNA-seq-Studien ergaben, dass die mRNA-Expressionsniveaus der SR-Proteine ​​stärker auf Dehnung reagieren als andere RBP-Familien. Nach der Phosphorylierung regulieren SR-Proteine ​​​​eine Vielzahl zellulärer Prozesse, einschließlich Spleißaktivierung, Spleißunterdrückung, Transkription, Translation und mRNA-Export40. Die von uns gefundenen mechanosensitiven Kassetten-Exons sind in Genen vorhanden, die Proteine ​​kodieren, die an der Transkription und Phosphorylierung beteiligt sind, zwei der Hauptfunktionen der SR-Proteine. Dies verleiht der Idee Glaubwürdigkeit, dass auf Dehnungen reagierende Spleißereignisse an ähnlichen Funktionen wie SR-Proteine ​​beteiligt sein und von diesen reguliert werden könnten.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass SRSF4 ein mechanosensitives RBP ist, da die Dehnung seinen Phosphorylierungsgrad verändert, was wiederum die nachgeschalteten Transkriptions- und Posttranskriptionsziele beeinflussen könnte. Tatsächlich gab es eine starke Überlappung zwischen den Genen, die auf Dehnung reagieren (transkriptionell und auf der Spleißebene, unsere Studie), und denen, die als SRSF4-Ziele bekannt sind. Da Skelettmuskelzellen mechanische Signale integrieren müssen, bestätigen die Phosphorylierungsänderungen von SRSF4 bei Dehnung die Idee, dass es möglich ist, einen SR-Protein-Modifikationscode zu haben, der auf mechanische Kräfte reagiert und die Mechanotransduktion beeinflusst40.

Akteure des MAPK-Signalwegs interagieren mit Kinasen vor einigen SR-Proteinen und ihren Zielen42,55,56. Interessanterweise liegen mehrere der Gene und Spleißereignisse, die auf die Überexpression und Zelldehnung von SRSF4 reagierten, im MAPK-Signalweg. Dies deutet darauf hin, dass SRSF4 eine Rolle bei der Schnittstelle zum MAPK-Signalweg spielt, und zwar durch eine durch mechanische Dehnung induzierte Veränderung seiner transkriptionellen und posttranskriptionellen Ziele.

Alternative Spleißprogramme sind bei einer Vielzahl von Muskelerkrankungen falsch reguliert57,58,59. Zahlreiche Studien haben Spleißveränderungen mit spezifischen Merkmalen und physiologischen Defekten von Skelettmuskelerkrankungen in Verbindung gebracht und die verantwortlichen RBPs identifiziert3,4,57,59. Mechanosensitive Gewebe wie Muskeln und Herz weisen während der Entwicklung ein hohes Maß an alternativem Spleißen auf2,14. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie sich Mechanotransduktion auf die alternative Spleißregulation auswirkt, um mehr Therapieoptionen für Erkrankungen der quergestreiften Muskulatur bereitzustellen. Muskeldehnungsexperimente bei Mäusen und Menschen weisen häufig Heterogenität auf, was es schwierig macht, die molekularen Mechanismen der Dehnung zu analysieren60,61. Auch wenn Untersuchungen an in einer Schale gezüchteten Muskelzellen nicht auf Muskelgewebe übertragen werden können, ist die Untersuchung der grundlegenden molekularen Mechanismen von Muskelzellen dennoch von großem Nutzen, um Ziele für zukünftige Untersuchungen im Gewebe klar zu ermitteln.

SRSF4 spielt eine Rolle bei Brustkrebs und reguliert das Spleißen einiger mechanosensitiver Proteine ​​in der quergestreiften Muskulatur43,62,63. Bei 8 % der Brustkrebserkrankungen ist SRSF4 mutiert, was zu einer Fehlspleißung wichtiger Krebstransformationsgene führt43. Darüber hinaus führte die Überexpression von SRSF4 in MCF-10A-Azinusstrukturen zu einer Fehlregulierung nachgeschalteter Genexpressions- und Spleißprogramme, was SRSF4 zu einem wichtigen Regulator machte43. Darüber hinaus führte die Abreicherung von SRSF4 in HeLa-Zellen zu einem signifikanten Anstieg des Einschlusses von Exon 7 des Überlebens von Motoneuron 2 (SMN2) vor der mRNA62. Dies ist wichtig, da die Verbesserung des SMN2-Exon-7-Einschlusses ein Ziel therapeutischer Strategien zur Behandlung von Patienten mit spinaler Muskelatrophie ist, die durch Defekte im SMN1-Gen verursacht wird, die zu einem SMN-Proteinmangel führen. SMN2 ist fast identisch mit SMN1, kann jedoch den SMN1-Verlust nicht kompensieren, wenn Exon 7 übersprungen wird, da ein dysfunktionales verkürztes SMN2-Protein produziert wird.

Im Herzen förderte SRSF4 den Exon-Einschluss des mechanosensitiven kardialen Troponin-T-Gens63. Das Ausschalten von SRSF4 in Mäuseherzen führte zu einer ventrikulären Hypertrophie und einer größeren Kardiomyozytenfläche zusammen mit Veränderungen in der Glukokortikoidsignalisierung64. In differenzierten Muskelzellen beobachteten wir, dass mechanosensitive Gene nach 3 und 6 Stunden Dehnung Proteine ​​kodieren, die am Steroidstoffwechsel beteiligt sind, was angesichts der Rolle von SRSF4 bei der Steroidsignalisierung im Herzen interessant ist64. Darüber hinaus zeigten Mäuseherzen, denen SRSF4 fehlte, keine umfangreichen Spleißveränderungen, zeigten jedoch ein erhöhtes SRSF6-Protein im Myokard, was darauf hindeutet, dass diese beiden SR-Proteine ​​ähnliche Ziele im Herzgewebe regulieren könnten64. Unsere Studie zeigte eine Überlappung zwischen Genen, die nach der Dehnung posttranskriptionelle Übergänge mit den Zielen der SRSF4- oder SRSF6-Überexpression durchlaufen, was darauf hindeutet, dass diese beiden RBPs ähnliche Spleißereignisse regulieren könnten. Darüber hinaus beobachteten wir nach 3 Stunden Zelldehnung einen signifikanten Anstieg des phosphorylierten SRSF6, ähnlich dem Anstieg des phosphorylierten SRSF4. Insgesamt belegen diese Studien und unsere Daten eine potenziell wichtige Rolle von SRSF4 bei der Regulierung der Expression und des Spleißens spezifischer Gene, von denen einige mechanosensitiv sind.

Muskelerkrankungen führen zu radikalen Veränderungen sowohl der Spleißung als auch der physikalischen Eigenschaften von Muskelzellen. Es gibt immer noch zahlreiche Muskelerkrankungen mit unbekannter Ursache. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die die globalen transkriptionellen und posttranskriptionellen Veränderungen aufgrund mechanischer Dehnung mit einem unvoreingenommenen RNA-seq-Ansatz in Skelettmuskelzellen untersuchte. Wir haben herausgefunden, dass die SRSF4-Phosphorylierung mechanosensitiv ist und es wurde nicht beschrieben, dass andere RBPs auf Dehnung in Skelettmuskelzellen reagieren. SRSF4 spielt möglicherweise eine Rolle beim molekularen Crosstalk zwischen Mechanotransduktion und alternativen Spleißnetzwerken im Muskel, indem es mit dem MAPK-Signalweg interagiert. Dies könnte ein wichtiger Schritt zum Verständnis des Zusammenhangs zwischen den gleichzeitigen molekularen und mechanischen Veränderungen sein, die bei Muskelerkrankungen auftreten. SRSF4 wird aufgrund seines bereits nachgewiesenen Einflusses auf die Transkriptions- und Posttranskriptionsregulation und seiner potenziellen neuen Rolle bei der Mechanotransduktion durch die MAPK-Kaskade ein attraktives Ziel für zukünftige Untersuchungen sein.

C2C12-Maus-Myoblastenzellen wurden von ATCC (CRL-1722) gekauft und als negativ für Mykoplasmen verifiziert. Die Authentifizierung der Zellen erfolgte durch Profilierung bekannter myogener Marker in Myoblasten und differenzierten Zellen mittels Echtzeit-PCR (qPCR). Myoblasten wurden bei 37 °C unter 5 % CO2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, kultiviert. Die Zellen wurden bei geringer Konfluenz (30–40 %) gehalten. Um die Differenzierung zu induzieren, wurden Zellen bei 90 % Konfluenz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in DMEM, ergänzt mit 2 % Pferdeserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, kultiviert.

C2C12-Myoblastenzellen wurden in BioFlex Collagen 1-Platten mit sechs Vertiefungen (Flexcell International, BF-3001 C) (50.000 Zellen pro Vertiefung für Myoblastenstudien und 200.000 Zellen pro Vertiefung für Studien mit differenzierten Zellen) in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 100, ausplattiert Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin. Die nicht gedehnten Zellen wurden ebenfalls auf BioFlex Collagen 1-Platten mit sechs Vertiefungen ausplattiert und mit Ausnahme der Streckungsperiode genau den gleichen Kultivierungsbedingungen wie die gedehnten Zellen unterzogen. Die Zellen wurden entweder vier Tage lang differenziert und dann mit einem FX-6000T-Spannungssystem (Flexcell International) 1 Stunde, 3 Stunden oder 6 Stunden lang (differenzierte Zellen) oder zwei Tage danach 1 Stunde, 3 Stunden oder 6 Stunden lang gedehnt Plattierung (Myoblasten). Das Dehnungsprotokoll war wie folgt: ½ Sinus, 16 % äquibiaxiale Dehnung, DC = 50 % und FREQ = 1 Hz. Laut den technischen Berichten von Flexcell entsprechen 16 % der Dehnung einer Dehnung von 0,16 und einem Druck von –69,5 (kPa). Sowohl gestreckte als auch nicht gestreckte Zellen wurden vor der RNA-Extraktion oder der Herstellung von Proteinlysaten mit PBS gewaschen.

Für RNA-seq-Experimente wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die RNA mit einem RNeasy Mini Kit von Qiagen (#74104) einschließlich eines DNase-Schritts (Qiagen, #79254) gemäß den Protokollen des Herstellers extrahiert. Für die anderen Experimente wurden die Zellen mit PBS gewaschen und TRIzol-Reagenz wurde verwendet, um die Gesamt-RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers zu extrahieren.

Mit RNA-seq analysierte RNA-Proben erfüllten die folgenden Qualitätsparameter: DV200 > 95, r28S:18 S > 2,8 und RNA-Integrationszahl (RIN) > 8,4. Zur Bibliotheksvorbereitung wurde die Kapa-mRNA-Strangmethode verwendet. Alle Proben wurden gepoolt und die Bibliothek wurde zunächst auf einem Illumina MiSeq Nano ausgeführt, um die Sequenzierungsqualität zu überprüfen. Nach der Qualitätsüberprüfung wurde die Bibliothek auf einer Fließzelle über vier Spuren auf einem NovaSeq 6000S4-Sequenzer in einem Paired-End-Lauf mit 2 × 100 Zyklen am High Throughput Sequencing Core der University of North Carolina in Chapel Hill ausgeführt.

Die Proben wurden mit dem UNC-CH jUNCtion-Programm verarbeitet, das die Proben mithilfe von STAR65 an das Ensembl mm10-Genom und das Ensembl mm10-Transkriptom anpasste und die Expression für die nachgelagerte Analyse mithilfe des Salmon-Programms quantifizierte66. Die Kartierungsraten sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Die Genexpression wurde mit DESeq267 berechnet. Gene galten als differenziell exprimiert, wenn der Benjamini-Hochberg-angepasste p-Wert padjusted < 0,05 und |log2FoldChange | war ≥0,58 (Fachveränderung >1,50 für hochregulierte Gene oder Faltveränderung <–1,50 für herunterregulierte Gene). Signifikante Änderungen in der Genexpression für Myoblasten finden Sie in den Zusatzdaten 2 und für differenzierte Zellen in den Zusatzdaten 3. Um das unterschiedliche alternative Spleißen als Reaktion auf die Dehnung zu bestimmen, wurden die Messwerte mit dem Gencode mm10-Genom und dem Gencode vM20-Transkriptom abgeglichen, die Referenzchromosomen und Gerüste enthielten , Assembly-Patches und Haplotypen. Das differenzielle Spleißen wurde mithilfe von MISO bestimmt und es wurden Datensätze erstellt, die die MISO-Zusammenfassungszahlen aller Proben zu jedem Zeitpunkt enthielten35. Diese Datensätze wurden dann verwendet, um die gestreckten Proben zu jedem Zeitpunkt mit den nicht gestreckten Kontrollen zu vergleichen. Die Ereignisse wurden nach Gesamtlesetiefe ≥15 und entweder Einschluss-Lesevorgängen ≥5 oder Ausschluss-Lesevorgängen ≥5 gefiltert. Nach dem Filtern wurden Ereignisse als alternativ gespleißt betrachtet, wenn |ΔPSI| (|PSIstretch–PSIno stretch|) >10 und der Wilcox-p-Wert (Stretch versus keine Stretch) ≤0,05. Signifikante Änderungen beim alternativen Spleißen für Myoblasten finden Sie in den Zusatzdaten 4 und diejenigen für differenzierte Zellen in den Zusatzdaten 5. In den Excel-Dateien werden die ΔPSI-Werte auf einer Skala von 0 bis 1 (für Einschluss) oder 0 bis –1 (für) angezeigt Ausschluss).

Die GO-Anreicherungsanalyse wurde an Genen durchgeführt, die ihre mRNA-Spiegel oder alternativen Spleißmuster als Reaktion auf die Zelldehnung veränderten, unter Verwendung der Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID)68,69. Die im vorherigen Abschnitt definierten unterschiedlich exprimierten Gene wurden für GO verwendet. Der −log10-angepasste p-Wert für die GO-Analyse von Genen, die sich bei Dehnung ändern, wurde aus dem von DAVID ausgegebenen Benjamini-Hochberg-angepassten p-Wert berechnet. Die GO-Analyse mit einem angepassten p-Wert von 0,25 ist ein allgemein akzeptierter Schwellenwert für die Hypothesengenerierung für GO70. Der −log10-p-Wert für die Signalweganalyse von Genen, die sich bei Dehnung ändern, wurde aus dem von DAVID ausgegebenen p-Wert berechnet. Die im vorherigen Abschnitt definierten Gene (in denen sich die unterschiedlich gespleißten Exons befanden) wurden für GO verwendet. Der −log10-Rang-p-Wert aus der GO-Analyse von Genen, die sich auf der Spleißebene (Kassetten-Exons) ändern, wurde aus den von DAVID ausgegebenen Rang-p-Werten berechnet.

Das High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, #4368813) wurde verwendet, um RNA mit nukleasefreiem H2O und RNase-Inhibitor (Applied Biosystems, N8080119) revers in cDNA zu transkribieren. Für die cDNA-Synthese wurde das folgende Programm verwendet: (i) 25 °C für 10 Minuten, (ii) 37 °C für 120 Minuten, (iii) 85 °C für 5 Minuten, (iv) 4 °C Pause.

PCR-Assays wurden unter Verwendung des GoTaq Green Master Mix (Promega, M7123) und Mausprimern (0,5 µM) durchgeführt, die auf konstitutive Exons abzielten, die die alternativ gespleißten Regionen flankierten (Supplementary Data 6). Die folgenden Amplifikationsbedingungen wurden verwendet: (i) 95 °C für 1 Minute und 15 Sekunden, (ii) 28 Zyklen von 95 °C für 45 Sekunden, 57 °C für 45 Sekunden, 72 °C für 1 Minute, (iii) 72 °C für 10 Minuten, (iv) 4 °C Pause. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese unter Verwendung eines 6 %igen Polyacrylamidgels in TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) für 4 Stunden bei 140 V aufgetrennt. Die Gele wurden 10 Minuten lang in wässriger Lösung gefärbt Lösung von 0,4 μg/ml Ethidiumbromid und visualisiert mit dem ChemiDocTM XRS + Bildgebungssystem (BioRad). Spleißgele wurden durch Densitometrie unter Verwendung der Image LabTM 6.0.1-Software (BioRad) quantifiziert.

25–100 ng cDNA wurden verwendet, um eine 20 µL qPCR-Reaktion unter Verwendung des Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Nr. 4444557) durchzuführen. Eine QuantStudio 7-Maschine wurde mit dem folgenden Protokoll verwendet: (1) 50 °C für 2 Minuten; (2) 95 °C für 20 s; (3) 95 °C für 1 s; (4) 60 °C für 20 s. Die Zyklusschwellenwerte für die qPCR-Validierung von Myoblasten und differenzierten Zellen (Ergänzungstabelle 1) wurden auf Hydroxymethylbilan-Synthase (Hmbs) (Mm01143545-m1, Amplikongröße 81 bp; Thermo Fisher Scientific) normalisiert. Die gestreckten Proben wurden ab demselben Zeitpunkt auf die nicht gestreckten Proben normalisiert. Die Zyklusschwellenwerte für qPCRs nach U0126-Behandlung (Ergänzungstabelle 1) wurden auf ribosomales Protein L13a (Rpl13a) (Mm01612986_gH, Amplikongröße 122 bp; Thermo Fisher Scientific) normalisiert. Die Proben wurden auf das Fahrzeug normalisiert, keine Streckprobe.

Die Zellen wurden unmittelbar nach dem Strecken auf Eis gelegt, mit eiskaltem PBS mit Protease (Roche, Nr. 11697498001) und Phosphataseinhibitoren (Sigma Aldrich, Nr. 4906845001) gewaschen und mit eiskaltem RIPA-Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1) lysiert % Triton Die Lysate wurden 15 Minuten lang auf Eis inkubiert und dann 3 Minuten lang mit 75 % Amplitude beschallt (30 Sekunden an, 30 Sekunden aus), weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert und 10 Minuten lang bei 4 °C und 14.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen überführt und bei –80 °C gelagert. Die Proteinkonzentrationen wurden gemäß den Herstellerprotokollen des Pierce BCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific, Nr. 23225) gemessen.

Gleiche Proteinmengen wurden in Ladepuffer verdünnt (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 12,5 mM EDTA, 10 % Glycerin, 2 % SDS, 0,02 % Bromphenolblau, 360 mM Beta-Mercaptoethanol). SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet, um Proben auf 4–15 % fleckenfreien Mini-Protean TGX-Gelen (BioRad, Nr. 4568084) zu analysieren, wobei ein Puffer verwendet wurde, der 192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base und 3,5 mM SDS enthielt , pH 8,3. Die Elektrophorese wurde 30 Minuten lang bei 90 V und anschließend 30 Minuten lang bei 150 V durchgeführt. Die Gele wurden auf einem ChemiDocTM XRS+-Bildgebungssystem (BioRad) abgebildet und die Proteine ​​wurden 1 Stunde lang bei 100 V unter Verwendung eines Transferpuffers mit 192 mM Glycin auf eine Amersham Hybond Low Fluorescent 0,2 µm PVDF-Membran (GE Healthcare Life Sciences, Nr. 10600022) übertragen , 25 mM Tris und 20 % Methanol, pH 8,3. Membranen wurden mit einem ChemiDoc Imaging System (BioRad) abgebildet, um das Gesamtprotein abzuschätzen. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur entweder mit 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Tween-haltiger Kochsalzlösung (TBST) (20 mM Tris-Base, 137 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,6) oder 1 % Rinderserumalbumin blockiert (BSA) in TBST. Die Membranen wurden mit TBST gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit den in 1 % BSA in TBST verdünnten Primärantikörpern wie folgt inkubiert: Anti-PhosphoERK1/2 von Cell Signaling (#4370, 1:2.000), Anti-ERK1/2 von Cell Signaling (#4695, 1:2.000), Anti-SRSF4 von Millipore Sigma (#06-1367, 1:500), Anti-SRSF5 von Millipore Sigma (#06-1365, 1:500), Anti-SRSF6 von Bethyl Laboratories (A303-669A-T, 1:1.000) und antiphosphorylierte SR-Proteine ​​von Sigma Aldrich (MABE-50, 1:750). Am nächsten Tag wurden die Membranen dreimal (jeweils 10 Minuten) in TBST gewaschen und mit dem sekundären Anti-Maus-Dylight 800 (Thermo Fisher Scientific, SA5-35521) oder Anti-Kaninchen-Dylight 800 (Thermo Fisher Scientific, SA5-35571) inkubiert. Antikörper 1:10.000 verdünnt in 1 % BSA in TBST für 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur und Schütteln. Die Membranen wurden mit einem Odyssey Licor Imager abgebildet.

C2C12-Zellen wurden vier Tage lang differenziert und dann vor dem Strecken 30 Minuten lang mit 20 μM ERK1/2-Phosphorylierungsinhibitor (Promega, U0126) inkubiert. Zellen, die nicht mit dem ERK1/2-Phosphorylierungsinhibitor behandelt wurden, wurden mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (Vehikel) behandelt. Die Zellen wurden 1 Stunde lang gestreckt. Protein und RNA wurden sofort für nachfolgende Analysen isoliert.

Für Myoblast RNA-seq wurden die Proben aus zwei unabhängigen Experimenten entnommen (zwei separate Proben aus jedem Experiment, also insgesamt vier Proben). Für die RNA-Seq der differenzierten Zellen wurden die Proben aus drei unabhängigen Experimenten entnommen (zwei separate Proben aus einem Experiment und eine Probe aus den anderen beiden unabhängigen Experimenten, also insgesamt vier Proben). Für alle anderen Experimente wurden mindestens drei unabhängige biologische Replikate erzeugt. Die Art der statistischen Analyse und die Anzahl der Wiederholungen sind in der Legende jeder Abbildung angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten RNA-seq-Daten sind im GEO-Repository unter der Zugangsnummer GSE190029 verfügbar. Die Quelldaten für jede Abbildung sind unter https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.6134205.v2 verfügbar.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04064-7

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Diese Arbeit wurde durch Startkapital (JG) und einen Jefferson Pilot Award (JG) der University of North Carolina at Chapel Hill, einem National Institutes of Health (NIH) R01 (NIH-NIGMS R01GM130866) (JG), unterstützt NCTraCs Pilot Grant (550KR181805) vom National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) (JG) und ein Career Development Award der American Heart Association (19CDA34660248) (JG). ERH wurde durch ein NIH-NIAMS F31 Predoctoral Fellowship (F31AR077381) und einen NIH-NIGMS Training Award (5T32 GM007092) unterstützt. Wir danken der High Throughput Sequencing Facility an der University of North Carolina at Chapel Hill für die technische Unterstützung, die vom University Cancer Research Fund, dem Comprehensive Cancer Center Core Support Grant (P30-CA016086) und dem UNC Center for Mental Health unterstützt wird und Suszeptibilitätsstipendium (P30-ES010126). MC wurde durch ein NIH-NIAMS F31-Vordoktorandenstipendium (1F31HL145983-01) unterstützt. JMT wurde von einem NIH-NHLBI R01 (1R01HL142879) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder einer anderen Finanzierungsquelle wieder. Wir danken dem Bioinformatics Core an der University of North Carolina in Chapel Hill für seine kontinuierliche Hilfe während dieses Projekts und sein jUNCtion-Programm zur Datenanalyse. Wir bedanken uns für die Unterstützung des Genetics and Molecular Biology Curriculum (GMB) der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken insbesondere Dr. Keith Burridge für zahlreiche wertvolle Diskussionen zu diesem Projekt.

Abteilung für Zellbiologie und Physiologie, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, 27599, NC, USA

Emma R. Hinkle, R. Eric Blue, Jacquelyn Davi und Jimena Giudice

Lehrplan für Genetik und Molekularbiologie (GMB), The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, 27599, NC, USA

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Aladin M. Boriek

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Joan M. Taylor & Jimena Giudice

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ERH führte alle experimentellen Arbeiten durch und analysierte die RNA-seq-Daten. REB half bei einigen Dehnungsexperimenten, führte einige Western-Blot- und qPCR-Assays für SR-Proteine ​​durch und half bei Western-Blot-Experimenten, um auf Kommentare von Gutachtern einzugehen. YH.T. trug zur MISO-Datenanalyse und -interpretation bei. JD half bei der qPCR-Analyse. ARC stellte Code für die MISO-Analyse bereit. AMB stellte in der Anfangsphase des Projekts Stretching-Protokolle bereit. MC sorgte für Schulung und Unterstützung bei der Nutzung der Flexcell-Geräte. JMT half bei der Ideenfindung für das Manuskript. JSP schulte und betreute ERH in Bioinformatik und half bei der Interpretation von RNA-seq-Daten. JG hat die Studie entworfen und überwacht. ERH und JG haben den Manuskriptentwurf geschrieben. Alle Autoren haben zum endgültigen Manuskript beigetragen und waren damit einverstanden.

Korrespondenz mit Jimena Giudice.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Marco Fritzsche und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Hinkle, ER, Blue, RE, Tsai, YH. et al. Die Dehnung von Muskelzellen induziert Transkriptions- und Spleißübergänge sowie Veränderungen in SR-Proteinen. Commun Biol 5, 987 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03915-7

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Eingegangen: 14. April 2022

Angenommen: 30. August 2022

Veröffentlicht: 19. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03915-7

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